Hibridación genética, qué es, tipos de técnicas

Por el proceso denominado hibridación genética dos cadenas sencillas de ácido nucleico se acoplan para formar una hebra de doble cadena, este concepto ha sido desarrollado y permite la utilización de sondas formadas por segmentos con secuencias de ácidos nucleicos específicos, que son marcadas y utilizadas para desarrollar técnicas de detección molecular, que permiten el diagnóstico de enfermedades hereditarias donde es posible revelar al lugar exacto de la mutación en el gen.

Definición de hibridación genética

Esta es una técnica que se empezó a utilizar en 1972 y desde entonces se utiliza ampliamente en biología molecular, debido a su versatilidad gracias a que se pueden hibridar tanto dos secuencias de ADN, como dos de ARN o una de ADN con una de ARN.  Por este motivo esta técnica permite detectar por medio de sondas marcadas secuencias específicas de ADN o ARN que permiten estudiar todo tipo de relaciones genéticas, medir características y homologías en las secuencias o aislar secuencias específicas que sea necesario detectar.

La técnica de hibridación genética consiste en la formación de una molécula de cadena doble (bicatenaria) de ácido nucleico que se forma de dos moléculas de cadena sencilla (monocatenaria), que se unen porque sus dos cadenas están formadas por ácidos nucleicos complementarios.  Esta técnica tiene como objetivo la detección en la muestra de una secuencia de nucleótidos de interés utilizando una sonda, que tiene una secuencia específica y es específica y complementaria a la secuencia que es quiere identificar.

Componentes

Para realizar esta técnica se necesitan dos secuencias, una secuencia diana (que es la secuencia que se va a detectar) y una sonda (que es la cadena de nucleótidos cuya secuencia de bases nitrogenadas es complementaria a la secuencia diana), las sondas deben estar marcadas para poder detectar el híbrido con la secuencia diana y visualizar los resultados.

En cuanto a las sondas estas pueden ser monocatenarias o bicatenarias y su tamaño puede oscilar de pequeños oligonucleótidos a miles de nucleótido dependiendo del tipo de muestra que se va a estudiar, la técnica a aplicar, el marcaje empleado y de la especificidad y sensibilidad del ensayo.

Estas dos últimas características son importantes para el diseño de la sonda.  La especificidad es la capacidad que tiene una sonda para unirse a la secuencia diana con la que hibrida, se considera que el tamaño mínimo para que sea específica es de 16 bases.  La sensibilidad es la probabilidad de detectar cantidades mínimas de híbrido sonda-diana y está en relación con el número de moléculas marcadoras que admite la sonda.

Se pueden clasificar a las sondas en función de su tipo, marcaje y método de obtención.  Los tipos de sonda pueden ser de DNA o RNA. El marcaje de puede hacer con isótopos radioactivos, fluorocromos, biotina, peroxidasa o fosfatasa entre otros.  Finalmente se pueden obtener por digestión con endonucleasas, clonación, PCR o síntesis química.

EL proceso de la hibridación genética

La técnica de hibridación genética está basada en el conocimiento de que las bases nitrogenadas tiene una complementariedad específica donde siempre una pirimidina (timina, citosina en ADN y citosina y uracilo en ARN) se une a una purina(adenina y guanina), donde en condiciones normales la guanina se une a la citosina mediante tres puentes de hidrógeno y la adenina se une con la timina mediante dos puentes de hidrógeno, esta especificidad de unión permite que una cadena simple pueda servir como molde en el momento dela síntesis de la cadena complementaria.

Existen dos procesos que permiten la formación de los pares complementarios, la desnaturalización y renaturalización de los ácidos nucleicos. 

Durante el proceso de desnaturalización se separan las dos cadenas complementarias, esta separación se hace aumentando la temperatura o el pH, es decir llevando la solución a pH básico. El aumento de temperatura rompe los puentes de hidrógeno lo que produce que las cadenas de separen, los pares Adenina-Timina al poseer dos puentes de hidrógeno se separan primero, mientras que los pares Guanina-Citosina por poseer tres puentes de hidrógeno necesitan una mayor temperatura para separase, este fenómeno hace que la temperatura de desnaturalización de una cadena esté directamente relacionada con la composición de bases en la cadena.

En cuanto la desnaturalización por pH es debida a que los grupos fosfato de la cadena son de carga negativa, al elevar el pH su repulsión causa la separación física de las cadenas, por este motivo este proceso puede realizarse utilizando agentes químicos como la formamida o la urea.

El proceso de renaturalización o hibridación se produce cuando las cadenas de ácido nucleico simples ya separadas se unen a las sondas marcadas.  Los factores que más influyen en este proceso son al igual que en la desnaturalización, la temperatura y el pH además de la fuerza iónica de la solución, la presencia de proteínas como las helicasas y el porcentaje de bases no complementarias presentes en el medio.  En cuanto a la sensibilidad de la reacción de renaturalización entre el fragmento de ácido nucleico y la sonda esta depende de la complementariedad, longitud y concentración de la sonda en el medio de hibridación.

La hibridación puede ocurrir en solución o inmovilizando la muestra sobre un soporte sólido, en los dos casos después de la hibridación se lava el exceso de sonda que no ha renaturalizado y luego se detecta y cuantifica la sonda hibridada.

Detección de la hibridación de la sonda con su secuencia de diana

Después de la hibridación de las cadenas es necesario detectar la sonda unida a su secuencia diana, para esto se utilizan marcadores que pueden ser isótopos radioactivos o marcaje inmunológico.

Los isótopos radioactivos son elementos químicos con la propiedad de emitir radiación, los más utilizados son el ³²P para marcar nucleótidos mientras que el ³H y ³⁵S son utilizados usualmente para hibridación in situ. La detección se hace un revelado autoradiográfico con una película de rayos x para detección cualitativa o por contaje de centelleo líquido para detección cualitativa, estos suelen ser utilizados en metodologías de hibridación en filtro como northern blot, sourther blod y dot blot y aunque es una técnica muy sensible está en desuso porque requiere equipos e infraestructura especial y personal entrenado.

Aunque el marcaje radioactivo es muy sensible, también puede ser peligroso para el personal que lo hace, esto ha llevado al desarrollo de marcajes con anticuerpos donde las sondas se marcan con nucleótidos que se están unidos a moléculas de digoxigenina y en el relevado se añaden anticuerpos específicos unidos a compuestos fluorescentes o luminiscentes que permiten su detección.

Otra forma de marcaje es con los fluorocromos, como los derivados de la fluoresceína y tiaminas, estos compuestos que emiten luz al ser excitados con luz ultra violeta son muy utilizados porque se pueden utilizar sondas marcadas con diferentes fluorocromos al mismo tiempo y esto permite detectar diversas secuencias diana simultáneamente.  Este tipo de técnica se utiliza micho en fitogenética y para su detección se requiere del uso de un microscopio de fluorescencia, lo que hace la metodología compleja y costosa.

Tipos de técnicas de hibridación genética

Se pueden clasificar en técnicas en medio sólido, técnicas en medio líquido e hibridación in situ.

En medio sólido: Las más utilizadas son southern, northern, dot blot y microarrays.  El procedimiento para el Southern y el Northern blot es el mismo, la diferencia es que en el Northern se analiza ARN y en el Sourthern ADN. 

En medio líquido: Está basado en la formación de los híbridos en solución, que luego se fijarán en la pared del pocillo de la placa para su detección, tiene como ventaja que se pueden analizar múltiples muestras de forma simultánea, las dos técnicas más utilizadas son captura del híbrido y ADN ramificado.

Hibridación in situ: Es un método histoquímico que detecta y/o identifica secuencias específicas de ácidos nucleicos (ADN o ARN) en tejido mediante el uso de sondas marcadas.  Está técnica no requiere la extracción de los ácidos nucleicos de las células de la muestra, de esta manera es posible detectar qué células tienen un gen determinado y en qué momento lo expresan.

La técnica de hibridación in situ se utiliza para identificar células infectadas con genomas virales, detectar infecciones latentes, tipificar distintas estirpes de virus, y diferenciar entre tipos de hongos, otra aplicación es la expresión génica en tumores, detección de aberraciones cromosómicas, trisomías, alteraciones genéticas.

Referencias

1. Bueno Topete M, & González Cuevas J (2013). Técnicas de hibridación. Salazar Montes A, & Sandoval Rodríguez A, & Armendáriz Borunda J(Eds.), Biología molecular. Fundamentos y aplicaciones en las ciencias de la salud. McGraw Hill. https://accessmedicina.mhmedical.com/content.aspx?bookid=1473&sectionid=102743956
2. García M (1990). Hybridization of nucleic acids: Basic and applications. Boletín de la oficina Sanitaria Panamericana (OSP); 109(3). https://iris.paho.org/handle/10665.2/16713
3. Real García M, Rausell Segarra C, Latorre Castillo A (2017). Técnicas de ingeniería genética. Editorial Sintesis. ISBN: 9788491710714. https://www.sintesis.com/data/indices/9788491710714.pdf
4. Anderson M (1999). Nucleic Acid hybridization. Taylor & Francis Publishers Limited. ISBN 1-85996-007-3. https://archive.org/details/nucleicacidhybri0000ande/page/n9/mode/2up